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    本發明提供一種選自於下述(i)或(ii)之胜肽：(i)一胜肽，具有序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列；及(ii)一胜肽，具有在序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列中從胺基末端數起第1位至11位之Xaa以外之1個以上28個以下之胺基酸進行保守性胺基酸取代、缺失、加成或插入而成之胺基酸序列。
    公开号:TW201309720A
    申请号:TW101103180
    申请日:2012-02-01
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Tohru Takahashi；Naoya Shinozaki；Takeshi Takizawa；Takako Kimura
    申请人:Daiichi Sankyo Co Ltd；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    胜肽庫
    本發明係關於胜肽、該胜肽之衍生物、該胜肽或該衍生物包含之胜肽所對應的核苷酸、包含核苷酸之載體、導入有該載體或核苷酸之細胞、包含培養該細胞之步驟而成之胜肽或其衍生物之製造方法、包含該胜肽及/或其衍生物而成之胜肽庫、結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物之鑑定方法、結合於標的分子之胜肽或其衍生物之製造方法、判定待驗胜肽或其衍生物是否結合於標的分子之方法、包含該核苷酸而成之核苷酸．庫、包含該胜肽或其衍生物、該核苷酸、該載體或該細胞而構成之組成物、包含該胜肽或其衍生物、該核苷酸、該載體或該細胞而構成之試藥等。
    TACI為TNF超級家族的成員，已知作用為當作B細胞之調節子。TACI在其胞外區具有2個富含半胱胺酸的分域(cysteine-rich domains：以下稱為「CRDs」)，並結合於二個配體(APRIL與BAFF)。天然中由於替代性切割(Alternative splicing)也會存在N末端側CRD有缺損的TACI，據報告C末端側CDR(TACI_d2)單獨相對於兩配體會呈現與胞外區全體(TACI_d1d2)為同等的結合活性(專利文獻1、非專利文獻)。
    但是，TACI_d2或其改變體是否對於內在性配體以外的分子呈現高度結合活性，到現在仍為未知。 [專利文獻]
    [專利文獻1]國際公開第2006/052493號小冊 [非專利文獻]
    [非專利文獻1]Melissa A，Starovasnik著，J.Biol.Chem，280卷(8號)，7218至7227頁，2005年發行(Melissa A.Starovasnik,J.Biol.Chem.,vol.280(No.8),pp7218-7227(2005))
    本案發明人等針對TACI_d2或其改變體努力探討，結果製作了包含對於內在性配體以外之分子顯示高度結合活性之胜肽庫而完成本發明。
    本發明，係關於以下等：
    (1)一種胜肽，選自於下述(i)或(ii)：(i)一胜肽，具有序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列；及(ii)一胜肽，具有於序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列中自胺基末端數起1位至11位之Xaa以外之1個以上28個以下之胺基酸進行保守性胺基酸取代、缺失、加成或插入而構成的胺基酸序列。
    (2)如(1)之胜肽，其中自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意之胺基酸。
    (3)如(1)或(2)之胜肽，其中自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為排除脯胺酸之任意之胺基酸。
    (4)如(1)至(3)中任一項之胜肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、會影響主鏈方位的胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中任一群組內進行。
    (5)如(1)至(4)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起1位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、甲硫胺酸、組胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、色胺酸、異白胺酸、天冬胺酸及蘇胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (6)如(1)至(5)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起2位之Xaa係選自於由色胺酸、白胺酸、甘胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸及蘇胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (7)如(1)至(6)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、白胺酸、丙胺酸、組胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸及絲胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (8)如(1)至(7)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起4位之Xaa係選自於由麩胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、酪胺酸、甘胺酸及苯丙胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (9)如(1)至(8)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起5位之Xaa係選自於由離胺酸、麩胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、組胺酸及色胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (10)如(1)至(9)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起6位之Xaa係選自於由甲硫胺酸、色胺酸、酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸及天冬胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (11)如(1)至(10)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起7位之Xaa係選自於由麩胺酸、天冬胺酸、丙胺酸、絲胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸及天冬醯胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (12)如(1)至(11)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起8位之Xaa係選自於由離胺酸、麩胺酸、丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、精胺酸及甘胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (13)如(1)至(12)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起9位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、麩胺酸、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (14)如(1)至(13)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起10位之Xaa係選自於由天冬胺酸、組胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸及白胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (15)如(1)至(14)中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起11位之Xaa係選自於由異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    (16)如(1)至(15)中任一項之胜肽，其具有序列表之序列編號1至16中任一者表示之胺基酸序列。
    (17)一種如(1)至(16)中任一項之胜肽之衍生物，係對於該胜肽實施化學性修飾或生物學性修飾而成。
    (18)一種核苷酸，其係下述(i)至(iii)中任一者：(i)一核苷酸，係包含編碼為如(1)至(16)中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列所構成之核苷酸而成；(ii)一核苷酸，係包含編碼為如(1)至(16)中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而成；及(iii)一核苷酸，係由編碼為如(1)至(16)中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列所構成。
    (19)一種載體，其係包含如(18)之核苷酸而成。
    (20)一種細胞，其係導入有如(18)之核苷酸或如(19)之載體。
    (21)一種如(1)至(16)中任一項之胜肽之製造方法，其係包含下述步驟(i)及(ii)而成：(i)培養如(20)之細胞；及(ii)從步驟(i)所獲得之培養物回收該胜肽。
    (22)一種胜肽庫，其係包含如(1)至(16)中任一項之胜肽及/或如(17)之胜肽之衍生物而成。
    (23)如(22)之胜肽庫，其中胜肽及/或胜肽之衍生物係利用包含如(21)之步驟(i)及(ii)而成的方法製備者。
    (24)如(22)或(23)之胜肽庫，其中在該胜肽庫中，為表現型(phenotype)的該胜肽或胜肽衍生物及該表現型所對應之為基因型(genotype)之核苷酸係直接的或間接的連結。
    (25)如(22)至(24)中任一項之胜肽庫，其中核苷酸為如(18)之核苷酸。
    (26)如(22)至(25)中任一項之胜肽庫，其係噬菌體呈現庫(phage display library)、核糖體呈現庫(ribosome display library)或核酸呈現庫(nucleic acid display library)。
    (27)一種結合於標的分子之如(1)至(16)中任一項之胜肽或如(17)之胜肽衍生物之鑑定方法，其係包含下述(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如(22)至(26)中任一項之胜肽庫包含之胜肽或胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收該結合於標的分子之胜肽或胜肽衍生物。
    (28)一種結合於標的分子之如(1)至(16)中任一項之胜肽或如(17)之胜肽衍生物之製造方法，其係包含下述(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如(22)至(26)中任一項之胜肽庫包含之胜肽或胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收該結合於標的分子之胜肽或胜肽衍生物；及(iii)將於前述(ii)回收之該胜肽或胜肽衍生物包含之胜肽利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備。
    (29)一種判定如(1)至(16)中任一項之胜肽或如(17)之胜肽之衍生物是否結合於標的分子之方法，其係包含下述(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如(1)至(16)中任一項之待驗胜肽或如(17)之待驗胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)當待驗胜肽或待驗胜肽衍生物結合於該標的分子時，決定該胜肽或待驗胜肽衍生物為陽性。
    (30)一種結合於標的分子之如(1)至(16)中任一項之胜肽或如(17)之胜肽之衍生物之製造方法，其係包含下述(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如(1)至(16)中任一項之待驗胜肽或如(17)之待驗胜肽衍生物與該標的分子接觸；(ii)當待驗胜肽或待驗胜肽衍生物結合於該標的分子時，決定該胜肽或待驗胜肽衍生物為陽性；及(iii)當於前述(ii)判定待驗胜肽或胜肽衍生物為陽性時，將該胜肽或胜肽衍生物包含之胜肽利用基因重組或體外轉譯進行製備。
    (31)一種核苷酸庫，其係包含如(18)之核苷酸而成。
    (32)如(31)之核苷酸庫，其中核苷酸為噬粒(phagemid)、黏質體(cosmid)或質體或其片段。
    (33)如(31)或(32)之核苷酸庫，其中核苷酸存在於原核或真核細胞內、或病毒DNA或RNA上或病毒粒子中。
    (34)一種組成物，其係包含如(1)至(16)中任一項之胜肽、如(17)之胜肽之衍生物、如(18)之核苷酸、如(19)之載體或如(20)之細胞而構成。
    (35)一種試藥，其係包含如(1)至(16)中任一項之胜肽、如(17)之胜肽之衍生物、如(18)之核苷酸、如(19)之載體或如(20)之細胞而構成。
    依照本發明，可提供對於挑選理想的結合於標的分子之胜肽為有用的胜肽庫。[實施發明之形態]
    本發明提供胜肽、胜肽衍生物、胜肽庫、核苷酸、載體、細胞、胜肽及/或其衍生物之製造方法、具有理想性質之胜肽及/或其衍生物之鑑定方法、具有理想性質之胜肽及/或其衍生物之製造方法、判定待驗胜肽或其衍生物是否結合於標的分子之方法、核苷酸庫、組成物、試藥等。以下敘述本發明之各種態樣，但本發明之態樣不限定於該等。 1.胜肽
    本發明提供胜肽。
    本發明之「胜肽」之含意，也包含「多胜肽」、「蛋白質」。又本發明中，該「胜肽」之含意也包含「胜肽之衍生物所包含之胜肽」。
    本發明之一態樣中，胜肽具有序列表之序列編號1表示之胺基酸序列。該胺基酸序列中，自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為任意之胺基酸，但較佳為排除半胱胺酸之任意之胺基酸，更佳為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意之胺基酸。
    本發明之更佳態樣中，該胺基酸序列中，自胺基末端數起1位之Xaa(相當於序列編號1之11位之胺基酸)，係選自於由麩醯胺酸、甲硫胺酸、組胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、色胺酸、異白胺酸、天冬胺酸及蘇胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起2位之Xaa(相當於序列編號1之13位之胺基酸)，係選自於由色胺酸、白胺酸、甘胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸及蘇胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起3位之Xaa(相當於序列編號1之14位之胺基酸)，係選自於由精胺酸、白胺酸、丙胺酸、組胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、麩胺酸及絲胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起4位之Xaa(相當於序列編號1之15位之胺基酸)，係選自於由麩胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、酪胺酸、甘胺酸及苯丙胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起5位之Xaa(相當於序列編號1之16位之胺基酸)，係選自於由離胺酸、麩胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、麩胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、組胺酸及色胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起6位之Xaa(相當於序列編號1之17位之胺基酸)，係選自於由色胺酸、酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸及天冬胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起7位之Xaa(相當於序列編號1之20位之胺基酸)，係選自於由麩胺酸、天冬胺酸、丙胺酸、絲胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸及天冬醯胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起8位之Xaa(相當於序列編號1之25位之胺基酸)，係選自於由離胺酸、麩胺酸、丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、精胺酸及甘胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起9位之Xaa(相當於序列編號1之28位之胺基酸)，係選自於由天冬醯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、麩胺酸、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起10位之Xaa(相當於序列編號1之31位之胺基酸)，係選自於由天冬胺酸、組胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸及白胺酸所構成之群組的胺基酸；自胺基末端數起11位之Xaa(相當於序列編號1之32位之胺基酸)，係選自於由異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸所構成之群組的胺基酸；又，自胺基末端數起1位至11位之Xaa，也可為選自於本段落記載之各群組中的胺基酸經保守性胺基酸取代而得者(在本發明之其他部分將詳述)。
    又，本發明之某一態樣中，胜肽具有在序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列內的自胺基末端數起1位至11位之Xaa以外之胺基酸經過取代、缺失、加成或插入而成之胺基酸序列。自胺基末端數起1位至11位之Xaa以外之序列表之序列編號1表示之胺基酸序列中，經取代、缺失、加成或插入之胺基酸之數目為1個以上28個以下即可，其下限為1個。其上限為28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、5個、4個、3個、2個，最小為1個。
    該胺基酸序列中，自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為任意之胺基酸，但較佳為排除半胱胺酸之任意之胺基酸，更佳為排除半胱胺酸及脯胺酸之任意之胺基酸，又更佳為選自於前述各群組之胺基酸、或該胺基酸經保守性胺基酸取代者。
    「保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)」，係意指取代為在機能方面為等價或類似之胺基酸。胜肽的保守性胺基酸取代，會對於該胜肽之胺基酸序列帶來靜態的變化。例如具有同樣極性的一個或二個以上之胺基酸在機能方面等價地作用，並對於該胜肽之胺基酸序列帶來靜態的改變。一般而言，在某群組內之取代會認為關於構造及機能為有保守性。然而，如該技術領域中具有通常知識者所明白，特定之胺基酸殘基發揮的作用可從含有該胺基酸之分子之三維構造的推敲決定。例如半胱胺酸殘基，比起還原型(硫醇)形式的極性低，可採氧化型(雙硫醚)形式。精胺酸側鏈之長脂肪族的部分，會在構造面及機能面構成重要特徵。又，包含芳香環之側鏈(色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸)可貢獻於離子-芳香族交互作用或陽離子-pi交互作用。於該情形，具有該等側鏈之胺基酸即使取代為屬於酸性或非極性群組之胺基酸，也能在構造面及機能面有保守性。脯胺酸、甘胺酸、半胱胺酸(二硫醚形式)等殘基可對於主鏈之立體構造提供直接的效果，故常常無法在構造上無變形地取代。
    保守性胺基酸取代如以下所示，包含基於側鏈類似性之專一性的取代(Lehninger，生化學、修訂第2版、1975年發行、73至75頁：L.Lehninger,Biochemistry,2nd edition,pp73-75,Worth Publisher,New York(1975))及典型的取代。
    (1)非極性胺基酸群組：丙胺酸(以下記載為「Ala」或簡化記載為「A」)、纈胺酸(以下記載為「Val」或簡化記載為「V」)、白胺酸(以下記載為「Leu」或簡化記載為「L」)、異白胺酸(以下記載為「Ile」或簡化記載為「I」)、脯胺酸(以下記載為「Pro」或簡化記載為「P」)、苯丙胺酸(「Phe」或簡化記載為「F」)、色胺酸(以下記載為「Trp」或簡化記載為「W」)、甲硫胺酸(以下記載為「Met」或簡化記載為「M」)
    (2)非帶電極性胺基酸群組：甘胺酸(以下記載為「Gly」或簡化記載為「G」)、絲胺酸(以下記載為「Ser」或簡化記載為「S」)、蘇胺酸(以下記載為「Thr」或簡化記載為「T」)、半胱胺酸(以下記載為「Cys」或簡化記載為「C」)、酪胺酸(以下記載為「Tyr」或簡化記載為「Y」)、天冬醯胺酸(以下記載為「Asn」或簡化記載為「N」)、麩醯胺酸(以下記載為「Gln」或簡化記載為「Q」)
    (3)酸性胺基酸群組：天冬胺酸(以下記載為「Asp」或簡化記載為「D」)、麩胺酸(以下記載為「Glu」或簡化記載為「E」)
    (4)鹼性胺基酸群組：離胺酸(以下記載為「Lys」或簡化記載為「K」)、精胺酸(以下記載為「Arg」或簡化記載為「R」)、組胺酸(以下記載為「His」或簡化記載為「H」)
    又，天然界存在的胺基酸，依據其共通的側鏈的性質可區分為如下的群組。
    (1)疏水性胺基酸群組：正白胺酸(Norleucine)、Met、Ala、Val，Leu，Ile
    (2)中性親水性胺基酸群組：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
    (3)酸性胺基酸群組：Asp、Glu
    (4)鹼性胺基酸群組：His、Lys、Arg
    (5)影響/主鏈之方位的胺基酸的群組：Gly、Pro
    (6)芳香族胺基酸群組：Trp、Tyr、Phe
    以下舉保守性取代之例，但發明之保守性胺基酸取代不限於該等。
    Ala可取代為例如Val，Leu、Ile、Met、正白胺酸、Pro、Phe、Trp。
    Arg可取代為例如Lys、His。
    Asn可取代為例如Cys、Ser、Thr、Gln、Tyr、Gly。
    Asp可取代為例如Glu。
    Cys可取代為例如Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln。
    Gln可取代為例如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn。
    Glu可取代為例如Asp。
    Gly可取代為例如Ser、Cys、Thr、Tyr、Asn、Gln、Pro、Asp、Glu。
    His可取代為例如Lys、Arg。
    Ile可取代為例如Leu、Val、Met、Pro、Ala、Phe、Trp、正白胺酸。
    Leu可取代為例如正白胺酸、Ile、Val、Pro、Met、Ala、Phe、Trp、Met
    Lys可取代為例如Arg、His。
    Met可取代為例如Ala、Val、Leu、Phe、Ile、Pro、Irp、正白胺酸。
    正白胺酸可取代為例如Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp。
    Phe可取代為例如Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr、Pro、Met。
    Pro可取代為例如Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Gly。
    Ser可取代為例如Thr、Cys、Asn、Gln、Gly、Tyr。
    Thr可取代為例如Val、Ser、Gly、Cys、Tyr、Asn、Gln。
    Trp可取代為例如Tyr、Phe、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met。
    Tyr可取代為例如Gly、Cys、Asn、Gln、Trp、Phe、Thr、Ser。
    Val可取代為例如Ile、Leu、Met、Trp、Phe、Ala、正白胺酸、Pro。
    具有包含該胺基酸而構成之胺基酸序列之本發明之胜肽具有之胺基酸序列，可列舉如以下者，但本發明之胜肽具有之胺基酸序列不限定於該等。
    SLSCRKEQGKQYWREKMDCECASKCGNHPDICAYFCEN(序列表之序列編號1：第4圖之1)
    SLSCRKEQGKQYLLREWDCDSCASECGSHPHYCAYFCEN(序列表之序列編號2：第4圖之2)
    SLSCRKEQGKMYLLKEWDCASCASACGNHPHYCAYFCEN(序列表之序列編號3：第4圖之3)
    SLSCRKEQGKHYLLKEYDCDSCASECGYHPDYCAYFCEN(序列表之序列編號4：第4圖之4)
    SLSCRKEQGKSYGAIMYDCSSCASYCGEHPWHCAYFCEN(序列表之序列編號5：第4圖之5)
    SLSCRKEQGKEYGAIAWDCSSCASYCGAHPFECAYFCEN(序列表之序列編號6：第4圖之6)
    SLSCRKEQGKNYIHQQWDCASCASECGGHPNYCAYFCEN(序列表之序列編號7：第4圖之7)
    SLSCRKEQGKWYMTWESDCKSCASWCGSHPFDCAYFCEN(序列表之序列編號8：第4圖之8)
    SLSCRKEQGKMYDLYGFDCRSCASMCGKHPDLCAYFCEN(序列表之序列編號9：第4圖之9)
    SLSCRKEQGKMYMVWTQDCKSCASWCGAHPVACAYFCEN(序列表之序列編號10：第4圖之10)
    SLSCRKEQGKIYNQYGFDCKSCASWCGKHPDMCAYFCEN(序列表之序列編號11：第4圖之11)
    SLSCRKEQGKIYMTWHDDCHSCASLCGSHPLFCAYFCEN(序列表之序列編號12：第4圖之12)
    SLSCRKEQGKDYMVFGQDCHSCASWCGKHPVACAYFCEN(序列表之序列編號13：第4圖之13)
    SLSCRKEQGKQYMAGHFDCNSCASRYGHHPLMCAYFCEN(序列表之序列編號14：第4圖之14)
    SLSCRKEQDKTYIEYGFDCRSCASGCGGHPLMCAYFCEN(序列表之序列編號15：第4圖之15)
    SLSCRKEQGKSYTSEWFDCASCASKYGKHPLVCAYFCEN(序列表之序列編號16：第4圖之16)
    本發明中，胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸、或其混合物(DL-胺基酸)，但若無明確特別記載時，意指L-胺基酸。
    又，本發明中，胺基酸也可為上述以外之胺基酸(以下簡便上總稱為「異常胺基酸」。)。異常胺基酸，例如在天然胜肽或蛋白質中發現的硒代半胱胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、焦離胺酸、焦麩胺酸、胱胺酸、羥基脯胺酸、羥基離胺酸、甲狀腺素、O-磷酸絲胺酸、鎖鏈素(dsmosine)β-丙胺酸、肌胺酸、肌酸、γ胺基酪酸、冠癭鹼(opine)、乙二酸二甲酯(tricholomic acid)、紅藻胺酸(kinic acid)、軟骨藻酸(domoic acid)、亞克洛米力酸(acromelic acid)等，非天然胺基酸可舉例如：Ac-胺基酸、Boc-胺基酸、Fmoc-胺基酸、Trt-胺基酸、Z-胺基酸等N末端保護胺基酸、胺基酸第三丁酯、苄酯、環己酯、茀酯等C末端保護胺基酸、二胺、ω胺基酸、β胺基酸、γ胺基酸、胺基酸之Tic衍生物、包含胺基膦酸之其他胺基酸等，但不限於該等。
    本發明之胜肽可以就化學合成、基因重組、體外轉譯等製造胜肽或蛋白質之方法為該技術領域中具有通常知識者所周知之方法製備。又，由本發明之庫等依照本發明之鑑定方法挑選之胜肽也可依照此等方法製備。
    化學合成法，例如第三丁氧基羰基(t-Butoxycarbonyl：Boc)法、9-茀基甲氧基羰基(9-Fluorenylmethoxycarbonyl：Fmoc)法等，但不限於該等。Fmoc法具有脫保護條件溫和，且從樹脂切出胜肽簡便等優點(Fmoc solid phase peptide synthesis：a practical approach,ed.by W.C.Chan,P.D.White Eds.,Oxford University Press,New York,2000.)。
    本發明中，「胜肽之衍生物」及「胜肽衍生物」係指對於本發明之胜肽施以化學性修飾或生物學性修飾。化學性修飾，係指於本發明之胜肽中或胜肽上，利用化學反應，亦即原子-原子間之鍵結之生成或切斷，使變化為與原本胜肽為不同的物質。生物學的修飾，係指於本發明之胜肽中或胜肽上，利用生物學的反應，亦即使用生物來源的蛋白質(酵素、細胞激素(cytokine)等)、核酸(核糖酶(ribozyme)等)、細胞、組織、器官或非人類個體，或該等直接的或間接的作用，而產生與原本胜肽為不同之物質。
    該「衍生物」只要是與原本胜肽不同之物質即可，不特別限定，例如包含天然產生之糖鏈或人工創出之糖鏈者、含有聚乙二醇(PEG)等聚合物者、含有合成化合物或天然化合物者、經標記者、含有對於固相化為必要之部分者、於胺基末端側連結有訊息胜肽者、包含精製或單離時利用之標籤(tag)者、及有表現型胜肽及該表現型所對應之基因型直接或間接連結者，以及此等當中二種以上組合成者等。
    本發明之胜肽衍生物，可以本發明之胜肽當作原料，利用化學反應、生化學反應、轉譯後修飾等就將胜肽或蛋白質進行化學性或生物學性修飾之方法而言為該技術領域中具有通常知識者為周知的方法製備。又，從本發明之庫等依照本發明之鑑定方法挑選之胜肽之衍生物，也可利用此等方法製備。又，利用使用具有理想之轉譯密碼子(codon)修飾能力之細胞的基因重組，也能製備有實施該轉譯後修飾之本發明之胜肽衍生物。再者，藉由於體外轉譯系添加修飾胺基酸，可製備包含該修飾胺基酸之本發明之胜肽衍生物。
    PEG化之方法，可舉例如使胜肽或蛋白質與N-Hydroxysuccimide Ester(NHS)-PEG反應之方法等，但不限於此方法。
    本發明之胜肽及其衍生物其較佳態樣係結合於標的分子。
    本發明之胜肽及其衍生物可採之形態，例如單離的形態(冷凍乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態、融合蛋白質、與異分子之組合體、結合於標的分子之形態等)、也包含其他胜肽等之物理性集合(包含本發明之胜肽庫)、在細胞表面上(大腸桿菌或酵母之細胞表面上等)表現或提示(與呈現同義)之形態(包含本發明之細胞)、在病毒粒子上表現或提示(與呈現同義)之形態等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。 2.核苷酸
    本發明提供核苷酸。
    本發明中，「核苷酸」為單核苷酸、寡核苷酸或聚核苷酸，也稱為「核酸」或「基因」。本發明之核苷酸，可舉例如DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、探針、寡核苷酸、聚核苷酸、引子、載體等，但不限於此等。又，本發明之核苷酸也可為單股核苷酸、雙股核苷酸及三條以上之核苷酸之組合體中任一者，包含DNA及RNA而構成的混合式單股核苷酸、包含該核苷酸與其互補鏈而構成之雙股、包含單股DNA及單股RNA而構成之混合式雙股、雙股RNA、分子內可具有雙股構造部分之單股核苷酸等，也都包含。再者，本發明之核苷酸也可含有天然產生的鹼基或單核苷酸以外之(人工所創造出)之鹼基或單核苷酸一或二種以上。
    本發明之較佳核苷酸，例如：包含由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而構成的核苷酸而成的核苷酸、包含編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而成的核苷酸等。該較佳核苷酸，也可包含編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列以外之鹼基序列及/或非核苷酸部分，也可施以化學性或生物學性修飾(記載於本發明之其他部分)。此等都包含在「核苷酸」。
    又，本發明之核苷酸，也包含由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而構成的核苷酸。
    本發明中，當本發明之胜肽具有之胺基酸序列係由某核苷酸之鹼基序列的一部分或全部編碼時，該核苷酸稱為「(該)胜肽所對應之核苷酸」，該胜肽稱為「(該)核苷酸所對應之胜肽」。
    本發明之胜肽所對應之核苷酸，可舉例如：包含由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸、包含編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸、由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成的核苷酸等，但不限於該等。
    本發明之核苷酸所對應之胜肽，含有包含由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列構成之胜肽而成之胜肽、包含由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列而成之胜肽、由本發明之核苷酸之鹼基序列之一部分或全部所編碼之胺基酸序列構成之胜肽、此等胜肽之中任一者的衍生物等，但不限於該等。
    本發明中，「表現型所對應之基因型」的表達方式也使用於與「胜肽所對應之核苷酸」為相同含意。同樣地，「基因型所對應之表現型」的表達方式也使用於與「核苷酸所對應之胜肽」為相同含意。
    本發明之核苷酸之化學性或生物學性的修飾物含有本發明之胜肽時，該修飾物也包含在前述本發明之「胜肽之衍生物」的含意。
    本發明之更佳核苷酸，例如前述較佳核苷酸當中結合於標的分子之包含由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成之核苷酸而成的核苷酸、結合於標的分子之包含編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列而成之核苷酸、結合於標的分子之由編碼為本發明之胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列構成的核苷酸等。
    本發明中，設計編碼為胺基酸序列之鹼基序列時，各胺基酸所對應之密碼子可使用一種或二種以上。如此，某胜肽或蛋白質具有編碼為單一胺基酸序列之鹼基序列也可有多種變化。選擇該密碼子時，可以將該胜肽所對應之基因型，亦即因應導入有含有該鹼基序列之核苷酸的細胞(宿主細胞)的密碼子用法(codon usage)選擇適當密碼子，或適當調整多數密碼子之使用頻度或比例。例如將大腸桿菌當作細胞(宿主細胞)使用時，可使用在大腸桿菌中之使用頻度高的密碼子設計鹼基序列。
    本發明之核苷酸，可以利用化學合成、基因重組等就製造核苷酸之方法而言為該技術領域中具有通常知識者為周知的方法製備。又，從本發明之庫等依照本發明之鑑定方法回收(包含挑選、濃縮、單離)之胜肽所對應之核苷酸，也可利用此等方法製備。
    本發明之核苷酸可採之形態，例如單離的形態(冷凍乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、包含該核苷酸之重組載體(本發明之載體)、導入有該核苷酸或該載體之細胞(本發明之細胞)、包含於病毒或病毒粒子之形態(包含含有當作本發明之載體之形態)、也包含其他核苷酸等之物理的集合(包含本發明之核苷酸庫)等之形態等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。 3.載體
    本發明提供重組載體(以下也簡化記載為「載體」)。
    本發明之載體，包含本發明之核苷酸，且只要是用於將本發明之核苷酸導入細胞、微生物或個體之構件即可，不特別限定，較佳為噬粒、黏質體、質體等核酸載體。
    本發明之載體，也可為感染原核細胞或真核細胞之病毒或病毒性載體。
    本發明中，「噬粒」係指除了質體複製起點以外，還包含從單股噬菌體誘導之第二複製起點的細菌質體。具有該噬粒之細胞，可於遭到M13或與其類似之助感染噬菌體的多重感染中，經由單股複製模式而複製噬粒。亦即，將單股噬粒DNA包裝在由噬菌體被覆蛋白質被覆之感染性粒子之中。如此，噬粒DNA能在感染細菌中以選殖體雙股DNA質體的形式形成，噬粒能從經多重感染之細胞之培養上清以噬菌體狀之粒子的形式形成。藉由為了使噬菌體狀之該粒子感染具有F性纖毛之細菌的該DNA而注入該細菌中，能使粒子本身再度形成為質體。
    若將含有本發明之胜肽所對應之核苷酸及噬菌體被覆蛋白質(coat protein)基因而構成之融合基因插入於該噬粒而感染細菌並且培養該細胞，能使該胜肽在該細菌上或噬菌體狀粒子上表現或提示(與呈現同義)，或以成為與該被覆蛋白質之融合蛋白質的形式產生於噬菌體粒子中或該細菌之培養上清中。
    例如若將含有本發明之胜肽所對應之核苷酸及噬菌體被覆蛋白質基因gpIII而構成之融合基因插入噬粒並且與M13或與其類似之助感染噬菌體一起使大腸桿菌多重感染，則能以包含該胜肽及該被覆蛋白質而構成之融合蛋白質的形式產生於該大腸桿菌之培養上清中。
    即使將噬粒改為使用環狀或非環狀之各種載體，較佳為使用病毒載體，也能依照該技術領域中具有通常知識者所周知的方法，將由該載體包含之本發明之核苷酸之鹼基序列所編碼的胜肽在導入有該載體之細胞或病毒狀粒子上表現或提示(與呈現同義)、或產生於該細胞之培養上清中。
    本發明之載體(重組載體)也可利用基因重組等該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。
    本發明之載體可採取的形態，例如經單離之形態(凍結乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、導入於細胞之形態(包含本發明之重組細胞)、也包含其他載體等之物理性集合(包含本發明之核苷酸庫之特定態樣)等，但不限於該等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。 4.細胞
    本發明在其一態樣中，提供重組細胞(以下也省略記載為「細胞」)。
    本發明之細胞，係包含本發明之胜肽所對應之核苷酸且表現該胜肽之細胞。該細胞之宿主細胞，可為真核細胞(包含株化細胞、初代培養細胞、繼代培養細胞)及原核細胞任一者，不特別限定。
    原核細胞可舉例如：例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等細菌細胞，但不限於該等。
    真核細胞可舉例如動物細胞、昆蟲細胞、酵母、真菌等，動物細胞例如猴的細胞COS細胞(Gluzman、Cell、23卷、1981年發行、175至182頁：Gluzman,Y.,Cell(1981),vol.23,pp175-182：美國生物資源保存中心編號ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(美國生物資源保存中心編號ATCC CRL-1658)、中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell：CHO細胞：美國生物資源保存中心編號ATCC CCL-61)、CHO細胞之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub與Chasin，Progress of National Academic of Science USA，77卷、1980年發行、4126至4220頁：Urlaub,G.and Chasin,L.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980),vol.77,pp4126-4220)等，但不限於該等。
    本發明之細胞，可藉由將本發明之核苷酸或載體導入宿主細胞而製備，但較佳為可藉由將本發明之載體利用轉染、轉形、形質導入等而導入宿主細胞以製備。
    本發明之細胞之製備能適用之載體，例如包含從能適合於該原核細胞之種來源的複製子(replicon)亦即複製起點、與調節序列、轉錄開始點、(轉譯之)開始密碼子與終止密碼子等選擇之一個以上鹼基序列之質體、黏質體、噬粒等，但不限於此等。又，該核苷酸或載體也可包含能對於導入有該載體或核苷酸之細胞賦予表現形質(表現型)之選擇性的鹼基序列。藉由將該載體或核苷酸導入宿主細胞並且培養獲得之細胞，能使本發明之胜肽表現。
    適於本發明之胜肽之轉譯後修飾的宿主細胞也可當作本發明之細胞使用。可適用該宿主細胞之本發明之細胞，可在製備本發明之胜肽衍生物之方法(之某態樣)中使用。
    本發明之細胞能採取之形態，例如經單離之形態(冷凍配製品、凍結乾燥配製品、溶液等)、結合於其他分子之形態(經固相化之形態等)、導入有本發明之核苷酸或載體之細胞(包含本發明之細胞)、在表面有本發明之胜肽表現或提示(與呈現同義)之細胞(包含本發明之細胞)、也包含其他細胞等之物理性集合(包含本發明之核苷酸庫及胜肽庫之特定態樣)等，但不限於此等，可任意選擇適於使用、保存等目的之形態。 5.胜肽之製造方法
    本發明又於其他態樣提供本發明之胜肽之製造方法。
    本發明之胜肽，如前述可利用化學合成、基因重組、體外轉譯等就製造胜肽或蛋白質之方法而言為該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。又，從本發明之庫等利用本發明之鑑定方法回收(包含挑選、濃縮、單離)之胜肽也可利用此等方法製備。
    本發明之胜肽之製造方法在某態樣中，係包含以下步驟(1-1)及(1-2)而成：(1-1)培養包含本發明之胜肽所對應之核苷酸且表現該胜肽等之細胞(本發明之細胞)；及(1-2)從該培養物回收該胜肽。
    又，本發明之胜肽之製造方法，在另一態樣中，係包含以下步驟(2-1)及(2-2)而成：(2-1)決定結合於標的分子之本發明之胜肽之胺基酸序列；及(2-2)利用化學合成或基因重組製備由該胺基酸序列構成之胜肽。
    再者，本發明之胜肽之製造方法在又另一態樣中，係包含以下步驟(3-1)及(3-2)而成：(3-1)製備本發明之胜肽所對應之mRNA；及(3-2)以前述(3-1)所獲得之mRNA當作模板，利用體外轉譯製備該胜肽。
    又，該等製造方法可以將本發明之鑑定方法適當組合作為事前之步驟。亦即可首先實施本發明之鑑定方法包含之步驟，再實施本發明之製造方法包含之步驟。本發明之胜肽之製造方法，也包含如此之更包含本發明之鑑定方法(之各步驟)而構成的方法。
    如此的本發明之胜肽之製造方法，例如係包含以下步驟(4-1)至(4-3)而成：(4-1)使本發明之胜肽庫包含之胜肽與標的分子接觸；(4-2)回收該結合於標的分子之胜肽；及(4-3)利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備經回收之胜肽。
    同樣地，該等製造方法也可將本發明之判定方法適當組合作為事前的步驟。亦即可以首先實施本發明之判定方法包含之步驟，再實施本發明之製造方法包含之步驟。本發明之胜肽等之製造方法，也包含如此之更包含本發明之判定方法(之各步驟)構成的方法。
    如此的本發明之胜肽等之製造方法，例如係包含以下步驟(5-1)至(5-3)而成：(5-1)使本發明之待驗胜肽與標的分子接觸；(5-2)當待驗胜肽為該結合於標的分子時，決定該胜肽為陽性；及(5-3)當前述(5-2)中，決定待驗胜肽為陽性時，利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備該胜肽。
    又，本發明提供胜肽之衍生物(胜肽衍生物)之製造方法。本發明之胜肽衍生物可藉由將該衍生物包含之胜肽利用上述方法(胜肽之製造方法)製備後，供實施化學反應、生化學反應、轉譯後修飾等而製備。
    本發明之胜肽衍生物之製造方法，可舉例：除了例如上述(1-1)及(1-2)、(2-1)及(2-2)、(3-1)及(3-2)、(4-1)至(4-3)、或(5-1)至(5-3)等各步驟以外，更包含以本發明之胜肽當作原料製備本發明之胜肽衍生物之步驟(以下稱為「衍生物製備步驟」)而成之方法，但不限於此等。
    又，藉由將具有理想的轉譯後修飾能力的細胞使用在本發明之胜肽之製造方法中，也可以施有理想之轉譯後修飾的胜肽的形式製備本發明之胜肽導體。於該情形，可藉由將具有例如理想的轉譯後修飾能力的細胞當作上述步驟之(1-1)及(1-2)中的細胞、或(2-2)、(4-3)及(5-3)中的基因重組應用的細胞(或宿主細胞)使用，而製備施有理想的轉譯後修飾的胜肽衍生物，但是製備本發明之(就胜肽衍生物之製造方法之態樣而言)胜肽之轉譯後修飾體之方法不限於此等。 6.庫
    本發明提供庫。
    本發明中，「庫」係指類似但不相同的分子的物理性集合(collection)。該集合可於例如一個容器中共存，但也可於不同的容器或固相支持體上之不同部位以群組形式或個別分子的形式以物理上為分離地存在。多數庫也可包含在相同集合。
    本發明之庫只要是非相同的本發明之胜肽及/或核苷酸的物理性集合即可，並無任何限定，例如噬菌體呈現庫、核糖體呈現庫、核酸呈現庫等。
    「噬菌體．呈現」，係指於纖維狀噬菌體(filamentous phage)等被覆蛋白質(coat protein)連結外來的胜肽或蛋白質，並以融合蛋白質的形式使在噬菌體狀粒子上表現或提示(與呈現同義)之技術(方法及其使用的構件)。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該胜肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「噬菌體．呈現」的含意。噬菌體呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之一態樣。
    「核糖體．呈現」，係指在體外轉譯中，以包含轉譯反應中形成之mRNA-核糖體-胜肽或蛋白質三者而成為複合體之形態，使胜肽或蛋白質表現或提示(與呈現同義)之技術(方法及其使用之構件)。在此，胜肽或蛋白質為該mRNA之轉譯產物。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該胜肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「核糖體．呈現」的含意。核糖體呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之另一態樣。
    「核酸呈現」，係指以包含核苷酸(與核酸為同義)、該核苷酸所對應之胜肽或蛋白質而成之複合體之形態，使胜肽或蛋白質表現或提示(與呈現同義)之技術(方法及其使用之構件)(Keefe,A.D與Szostak、Nature、410卷、715至718頁、2001年發行：Keefe,A.D and Szostak,J.W.,Nature,vol.410(2001),pp715-718)。又，利用該技術回收(包含挑選、濃縮、單離)該胜肽或蛋白質所對應之核苷酸也包含在「核酸呈現」的含意。核酸呈現庫係在該技術中使用之本發明之庫之又另一態樣。
    核酸呈現可舉例如mRNA呈現，但不限於此。(Yamaguchi,J.et al.,Nucleic Acids Research,vol.37,No.16 e108,pp1-13(2009))
    mRNA呈現，係以mRNA與其轉譯產物即胜肽或蛋白質經由中介部分夾持而連結而成的複合體的形態使胜肽或蛋白質提示(與呈現同義)之技術(Keefe與Szostak，Nature，410卷、715至718頁、2001年發行：Keefe,A.D and Szostak,J.W.,Nature,vol.410(2001),pp715-718)。
    本發明中，包含不相同的本發明之胜肽及/或核苷酸之物理性集合之細胞之物理性集合、微生物(包含病毒、噬菌體、噬菌體狀分子、此等之任一之粒子等)之物理性集合、及天然產生或人工創出之載體(包含噬粒、黏質體、質體等)之物理性集合、及此等片段之物理性集合、及科學性及/或生物學性的修飾物之物理性集合，也包含在「庫」之含意。
    如前述，本發明中在設置編碼胺基酸序列之鹼基序列時，可以使用各胺基酸所對應之1種或2種以上之密碼子。如此，某胜肽或蛋白質具有之編碼為單一胺基酸序列之鹼基序列可以有多數的變化(variation)。該密碼子選擇時，可以因應該胜肽所對應之基因型，亦即包含該鹼基序列之核苷酸所導入之細胞(宿主細胞)之密碼子用法(codon usage)而選擇適當密碼子、或適當調整多數密碼子之使用頻度或比例。如此，本發明之核苷酸庫中，編碼為單一之胺基酸序列之鹼基序列之核苷酸可以有多種變化。亦即，本發明之核苷酸庫，也可包含含有編碼為某胜肽具有之胺基酸序列之鹼基序列之核苷酸之物理性集合。該特定胜肽所對應之核苷酸之物理性集合，其本身也可形成一個核苷酸庫。
    本發明之庫包含多個類似但不相同的分子。庫包含之類似分子之種類(之數目)稱為「庫之多樣性」。例如由100種類似分子構成之庫之多樣性為102。本發明中，庫之多樣性不特別限定，但其數值愈高愈好。
    本發明之鑑定方法及包含該鑑定方法之步驟的胜肽之製造方法中，使用之胜肽庫之多樣性，為1×105以上、2×105以上、5×105以上、1×106以上、2×106以上、5×106以上、1×107以上、2×107以上、5×107以上、1×108以上、2×108以上、5×108以上、1×109以上、2×109以上、5×109以上、1×10100以上、2×1010以上、5×1010以上、1×1011以上、2×1011以上、5×1011以上、1×1012以上、2×1012以上、5×1012以上、1×1013以上、2×1013以上、5×1013以上、1×1014以上、2×1014以上、5×1014以上、1×1015以上、2×1015以上、5×1015以上、1×1016以上、2×1016以上、5×1016以上、或1×1017以上。該庫之多樣性不限於實測值，也可為理論值。 7.鑑定方法
    本發明提供結合於標的分子之胜肽及/或胜肽衍生物之鑑定方法。 (1)標的分子
    本發明中，「標的分子」係指本發明之胜肽所結合之內在於人類或非人類動物個體之物質或能攝入活體內之外因性之物質。本發明之標的分子，較佳為直接或間接涉及個體會罹患之疾病之發病或惡化，或與該疾病顯示相關性或逆相關性之內在或外因性酵素、受體、該受體之配體、細胞激素等液性因子、其他活體高分子、訊息傳遞物質、細胞、病原體、毒素、或此等任一者以上或更多而來的物質，例如其片段、分解物、代謝產物、加工物等。又，本發明之標的分子也可為礦物、聚合物、塑膠、合成低分子化合物等非天然物質。
    本發明之標的分子係使用在從本發明之胜肽庫挑選該結合於標的分子之胜肽。該標的分子可為全長分子或其片段、或有任意之胺基酸、胜肽、蛋白質、糖鏈、聚合物、擔體等加成而得之衍生物。又，該標的分子也可經固相化。 (2)標的分子之製備
    本發明之標的分子可以從罹病的組織、細胞單離、精製後使用。又，本發明之標的分子，可利用化學合成、基因重組、體外轉譯等就胜肽或蛋白質之製造方法而言為該技術領域中具有通常知識者周知之方法製備。也可從如此獲得之標的分子視需要製備如前述衍生物。
    本發明中，胜肽或蛋白質可藉由體外轉譯，即，將包含胜肽或蛋白質所對應之DNA、cDNA等核苷酸或該核苷酸之載體於含有對於轉錄及轉譯為必要之酵素、基質、能量物質等之溶液中保溫而於體外合成理想的胜肽或蛋白質的方法、基因重組，亦即將該核苷酸或載體導入於原核或真核細胞(宿主細胞)並培養獲得之重組細胞後從該培養物回收理想的胜肽或蛋白質之方法、化學合成等製備。
    標的分子為存在於細胞膜之蛋白質或其分域(domain)時，也可藉由將連結該蛋白質或分域之細胞外區域與免疫球蛋白(Ig)之不變區而成之融合蛋白質於適當的寄主-載體系中表現而以分泌蛋白質之形式製備該分子。
    標的分子所對應之核苷酸可利用例如表現選殖法取得，但不限於此。表現選殖法，係構建編碼為包含胜肽或蛋白質之胺基酸序列之鹼基序列之cDNA之表現庫，以該cDNA庫當作模板，並使用專一性放大該cDNA之全長或一部分的引子，進行聚合酶連鏈反應(以下稱為「PCR」：Saiki等人、Science、239卷、487至489頁、1988年發行：Saiki,R.K.,et al.,Science(1988),vol.239,pp487-489)，藉此選殖胜肽或蛋白質所對應之cDNA之方法。
    體外轉譯可應用之套組或試藥，例如Roche Diagnostics公司製之快速轉染系統(RTS)等。
    基因重組之宿主細胞，可適當選擇能適用於當作製備本發明之細胞用的宿主細胞的原核或真核細胞。
    基因重組中，所獲得之重組細胞(有核苷酸或載體導入之細胞)可依照該技術領域中具有通常知識者周知之方法培養，能在該培養物中或該細胞內使理想的胜肽或蛋白質產生。
    該培養可使用之培養基可因應宿主細胞從慣用者當中適當選擇。宿主細胞為大腸桿菌時，例如可於LB培養基視需要添加安比西林等抗生物質或IPTG以供培養。
    利用該培養，並將重組細胞內外產生之理想的胜肽或蛋白質藉由利用其物理性、化學性及/或生物學的性質等之公知之區分手法適當組合可精製及單離。
    該區分手法，例如鹽析、利用蛋白質沉澱劑處理、透析、超過濾、分子篩(凝膠過濾)層析、吸附層析、離子交換層析、親和性層析、分配層析、疏水層析等，但不限於此等。
    又，藉由對胜肽或蛋白質預先將對於精製有用之部分予以連結或加成，能以良好效率精製理想的胜肽或蛋白質。例如藉由預先連結由6個殘基構成的組胺酸標籤，能利用鎳親和性層析以良好效率精製理想的胜肽或蛋白質。又，藉由預先連結IgG之Fc區，能利用Protein A．親和性層析以良好效率精製理想的胜肽或蛋白質。 (3)標的分子與胜肽及/或胜肽衍生物之接觸
    本發明之鑑定方法，包含使胜肽及/或其衍生物與標的分子接觸之步驟。在此，該胜肽及/或其衍生物也可包含在胜肽庫中。亦即本發明之鑑定方法也可包含使胜肽庫包含之胜肽及/或其衍生物與標的分子接觸之步驟。
    本發明中，「使接觸」，係指使兩或更多物質接近到該物質當中二個以上之間能交互作用之距離。該交互作用可舉例如共價鍵、配位鍵、金屬-金屬間鍵結、離子鍵、金屬鍵、氫鍵、凡得瓦鍵等(以下稱為「化學鍵」。)、基於利用庫倫力之結合、離子間交互作用、氫鍵、雙極子交互作用、凡得瓦力等靜電交互作用之交互作用(以下稱為「分子間力」。)、其他交互作用、電荷移動交互作用、渡環交互作用、疏水交互作用、胜肽與活體分子之組合等，但不限於此等。本發明中，「兩或更多之物質」只要含有標的分子及待驗物質即可，不特別限定。待驗物質只要是結合於標的分子之物質即可，不特別限定，例如本發明之胜肽、該胜肽之衍生物、此等中任一者經固相化之擔體、有此等之任一者表現或提示(與呈現同義)之細胞、病毒粒子或病毒狀粒子(包含噬菌體、噬粒)等。該待驗物質也可藉由噬菌體．呈現、核糖體．呈現、核酸呈現等，真核或原核細胞表面上、病毒粒子或病毒狀粒子上、或以連結於核糖體或核酸的形態表現或提示(與呈現同義)。 (4)挑選
    本發明之鑑定方法包含挑選具有理想的性質之胜肽及/或胜肽衍生物，較佳為結合於標的分子之胜肽及/或胜肽衍生物之步驟。
    本發明中，「結合」係指在某條件下，兩或更多物質以此等之間能發生交互作用(記載在本發明之其他部分)的程度彼此接近或成為組合之狀態。
    本發明中，即使在某條件之下，使標的分子與待驗物質接觸，其次使與該標的分子非專一性吸附之待驗物質及未與該標的分子結合或吸附之待驗物質從含有待驗物質之級分除去後，只要在該級分中仍存在待驗物質，便可解讀為該待驗物質與該標的分子「結合」。
    兩或更多物質之間僅能產生非專一性吸附時，可解讀為此等物質之間未發生「結合」。又，即使使兩或更多物質接觸，此等之間仍未彼此接近到能產生交互作用(記載於本發明之其他部分)之程度或未成為組合之狀態時，可解讀為此等物質之間未產生「結合」。
    測定抗體與抗原之「結合」之方法，廣泛使用利用流式細胞計數方法等測定之螢光抗體法(直接法、間接法)、放射免疫分析、酵素免疫分析(均勻法、不均勻法)、ELISA、ELISPOT等。該等方法中，只要將待驗抗體及抗原替換為本發明之胜肽或其衍生物及標的分子，便可與抗體與抗原之「結合」測定同樣地，測定是否有胜肽或其衍生物與標的分子之「結合」。
    又，「結合」之有無，可利用測定結合活性或親和性之指標而決定。結合親和性之指標例如解離常數、結合常數等。
    針對以下表示之處於化學平衡狀態之分子A及結合於A之物質B之化學的解離，ABA+B
    解離常數(dissociation constant：Kd)可由下式計算：Kd=[A][B]/[AB]
    在此，[A]、[B]及[AB]分別意指A、B及AB(組合體)之濃度。Kd意指經解離之A及B與未解離之AB之比，Kd之倒數為結合常數(Ka)。
    本發明中，使用的「解離常數(dissociation constant)」主要意指用於結合於某標的分子之之胜肽及/或胜肽衍生物之平衡(equilibrium)解離常數。
    本發明中，解離常數，可藉由測定經解離之物質(胜肽、胜肽衍生物、標的分子等)及未解離之物質(胜肽及/或胜肽衍生物-標的分子組合體等)之濃度而計算。解離常數之測定-計算方法，只要是該技術領域中具有通常知識者所周知的方法即可，不特別限定，例如使用表面電漿子共振之方法、等溫滴定熱量測定法等。
    使用表面電漿子共振之方法中，標的分子及與其結合之胜肽及/或其衍生物之交互作用可利用以下測定-計算：在多種胜肽濃度，利用表面電漿子共振檢測一系列的結合．解離反應；解析獲得之一系列結合．解離反應；從得到的各種速度常數計算解離常數。
    表面電漿子共振之測定-計算系統，例如Biacore系統(GE Healthcare公司)等但不限於此。使用Biacore系統時之程序如下：以胺基偶聯將標的分子固定化在Biacore系統之感應晶片上；於多數胜肽濃度，使該標的分子接觸胜肽；利用表面電漿子共振檢測兩者的交互作用；將一系列結合．解離反應以時間為橫軸、結合量(RU)為縱軸繪製感應圖；從以多數胜肽濃度繪製的感應圖，使用BIAevaluation軟體(GE Healthcare公司製)擬合(fitting)於Langmuir模型，計算各種速度參數；從各種速度參數計算解離常數。
    等溫滴定熱量測定法中，標的分子及與其結合之胜肽及/或其衍生物之交互作用可以如下測定-計算：於含有標的分子之溶液中滴加胜肽溶液(反之亦可)；測定交互作用產生的熱量，繪製結合等溫線；從結合等溫線可獲得解離常數(KD)、反應之結合比(N)、焓(enthalpy)變化(△H)、熵(entropy)變化(△S)。
    直接測定伴隨分子間交互作用之微小熱變化(發熱變化或吸熱變化)的系統，例如MicroCal．系統(GE Healthcare公司)等，但不限於此。使用MicroCal．系統時之程序如下：於保持在固定溫度的樣本槽滴定配體溶液並攪拌；由於分子間交互作用，會產生與結合量為正比例之發熱或吸熱，且樣本槽中之溶液溫度發生變化；槽回饋網絡(cell feedback network)(CFB)感知與參考槽之間的溫度差(△T)；將參考槽或樣本槽加熱使△T為0；測定為了保持△T=0所要花費的回饋電力，藉此獲得交互作用所生的發熱量或吸熱量；以發熱量為縱軸、標的分子與胜肽之莫耳比為橫軸，從結合等溫線計算解離常數。
    本發明之鑑定方法及/或判定方法(後述)中，可將例如對於標的分子顯示100μM以下、50μM以下、20μM以下、10μM以下、5μM以下、2μM以下、1μM以下、500nM(0.5μM)以下、200nM以下、100nm以下、50nM以下、20nM以下、10nM以下、5nM以下、2nM以下、1nM以下、500pM(0.5nM)以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、2pM以下、或1pnM以下之解離常數之待驗物質決定為結合於標的分子，亦即陽性，但解離常數之基準值、及決定是否有「結合」之基準不限於該等。
    本發明之鑑定方法中，「挑選」之步驟，亦為回收結合於標的分子之待驗物質之步驟，於該產物中只要是含有結合於標的分子之待驗物質或經濃縮即可，該產物可為僅由該結合於標的分子之物質構成者、及混有未與該標的分子結合之物質者任一者。又，該產物中含有或濃縮之結合於標的分子之待驗物質，可為單一物質也可為2種以上之混合物。
    本發明之鑑定方法中，挑選步驟亦即回收步驟，係指回收結合於標的分子之物質所含之或濃縮之級分之步驟。該步驟只要是在本發明之技術領域中為該技術領域中具有通常知識者周知之區分-精製方法即可，不特別限定，也可含有以下步驟：使結合於標的分子之物質、與未與標的分子結合之物質及與標的分子非專一性吸附之物質，從標的分子(含有其之級分)分離之步驟、將結合於標的分子之物質予以溶出(從標的分子分離)之步驟等。該步驟中，也可不就是否有結合設定解離常數等判定基準。
    本發明中，本發明之鑑定方法包含之「挑選」有時稱為「淘選(panning)」。本發明中，「淘選」係指使本發明之胜肽及/或胜肽衍生物與標的分子接觸，並回收(包含挑選、濃縮、單離)該結合於標的分子之胜肽及/或胜肽衍生物。
    淘選可以應用該技術領域中具有通常知識者所周知的方法，例如固相淘選法、液相淘選法，但不限於該等。固相淘選法，藉由例如將標的分子予以固相化，其次使液相包含之胜肽與該標的分子接觸，然後除去未與標的分子結合之胜肽及非專一性結合之胜肽後，選擇性地使該結合於標的分子之胜肽從固相(所結合之該標的分子)分離，可以挑選具有理想的結合活性的胜肽，但固相淘選法之操作不限於此。液相淘選法，例如可於溶液中使胜肽與該標的分子接觸，其次除去未與標的分子結合之胜肽及非專一性結合之胜肽後，選擇性地使該結合於標的分子之胜肽從該標的分離，藉此挑選具有理想的結合活性的胜肽，但是液相淘選法之操作不限於此。
    本發明之鑑定方法中，表現型(與phenotype：表現形質為同義)所對應之基因型(genotype：與基因形質同義)連結的庫，能以良好效率挑選結合於標的分子之胜肽(也包括「胜肽衍生物包含之胜肽」)所對應之核苷酸，而以良好效率製備該胜肽。表現型及其所對應之基因型(以下簡稱為「表現型與基因型」)之連結，可為直接性及間接性任一者。
    表現型與基因型「直接連結」，係指表現型與基因型之行為一致。即使表現型與基因型之間插入有其他部分等有一定的距離，只要兩者的行為一致，仍包括在「直接連結」的含意。亦即兩者不需物理性相鄰。
    本發明中，表現型與基因型之「行為一致」，係指本發明之胜肽、核苷酸、載體、細胞、製造方法、鑑定方法、判定方法、胜肽庫、核苷酸庫、組成物、試藥等態樣中，兩者之行為一致。此等態樣中，即使由於隨時間、暫時性地在直到某時點為止、或某時點之後、內部原因、外部原因、此等之組合或其他原因，使得「行為一致」有全體的或部分喪失，仍然包括在「行為一致」的含意。
    表現型與基因型直接連結者，例如核糖體呈現庫、核酸呈現庫、以本發明之胜肽所對應之核苷酸直接或間接連結為特徵之胜肽及/或其衍生物、含有該胜肽及/或其衍生物而成之胜肽庫等。
    表現型與基因型「間接連結」，係指兩者之行為不一定要一致，但是能從特定的表現型接近(access)該表現型所對應之基因型。表現型與基因型間接連結者，例如噬菌體呈現庫、表現選殖使用之cDNA庫等，但不限於該等。
    噬菌體呈現庫包含之各選殖體中，當作表現型之胜肽或其衍生物、與其所對應之當作基因型之核苷酸之行為雖不一致，但是可藉由經過使該庫包含之胜肽及/或其衍生物與標的分子接觸，除去未與標的分子結合、或與標的分子非專一性吸附之噬菌體狀粒子後，選擇性地使結合於標的分子之噬菌體狀粒子溶出等步驟，挑選結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物(於噬菌體狀粒子上表現或提示)，且同時，可將對應的基因型，亦即該胜肽或其衍生物(包含之胜肽)所對應之核苷酸予以精製、單離並決定其鹼基序列。從如此的表現型接近(access)其所對應之基因型的好處在於，不限於噬菌體．呈現等表現型與基因型係「間接連結」的情形，於「直接連結」的情形也可適用。
    本發明之鑑定方法包含之步驟可以重複2次以上。尤其，藉由將於挑選步驟回收之胜肽及/或胜肽衍生物重新構建胜肽庫並進行接觸及挑選的步驟，能將結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物更高度濃縮。藉由再重複此等操作，能使結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物又更高度濃縮，最終可提高將該等單離的效率。再者，藉由使結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物更為高度濃縮，能將親和性更高的結合劑單離。
    又，結合於標的分子之胜肽及/或其衍生物之高度濃縮，也可藉由於本發明之鑑定方法包含之步驟中將與標的結合之胜肽及/或其衍生物為非專一性結合者更強力分離而達成。如此的分離方法，可舉例如增加去除非專一性結合之胜肽等之步驟的次數、或使用於去除非專一性結合之胜肽使用之試藥(界面活性劑等)改為更強力者等。
    本發明之胜肽或其衍生物也可採取單元體、均或雜二元體、三元體、四元體、五元體、六元體、七元體、八元體、或由九個以上之單元體構成之多元體中任一形態。
    結合於標的分子一分子或標的部位一處之本發明之胜肽或其衍生物之分子數，可為1、2、3、4、5、6、7、8、或9以上任一者，該胜肽或其衍生物可以單元體、均或雜二元體、三元體、四元體、五元體、六元體、七元體、八元體、或由九個以上之單元體構成之多元體中任一形態結合於標的分子。
    本發明之胜肽或其衍生物每一分子結合之標的分子之分子數或標的部位數可為1、2、3、4、5、6、7、8、或9以上任一者。 8.組成物
    本發明提供組成物。
    本發明之組成物，係包含本發明之胜肽、胜肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞而構成。
    包含本發明之由胜肽或其衍生物(包括本發明之細胞表面上所提示者)而構成的組成物，可利用於檢測該胜肽或其衍生物所結合之標的分子。
    本發明之包含核苷酸、載體或細胞而構成的組成物，可以使用於製備該核苷酸、具有該載體或該細胞包含之本發明之核苷酸具有之鹼基序列所編碼之胺基酸序列的胜肽。又，該組成物也可使用於檢測包含該核苷酸之核苷酸、載體、細胞等。
    該組成物中，視需要可利用緩衝劑、鹽類、金屬、防腐劑、界面活性劑、冷凍或冷凍乾燥等製備方法使含有用於減輕或防止本發明之胜肽、胜肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞受到損害的物質等。 9.試藥
    本發明提供試藥。
    本發明之試藥係包含本發明之胜肽、胜肽之衍生物、核苷酸、載體或細胞而構成。
    本發明之由包含胜肽或其衍生物構成之試藥，可用於檢測該胜肽或其衍生物所結合之標的分子。
    例如腫瘤組織內存在之HER2蛋白質之量可利用稱為免疫組織化學解析(IHC)之檢查測定。檢査結果於0(陰性)至3+(強陽性)的範圍判定。可認為腫瘤以IHC代表為3+的患者高度可能受惠於Herceptin的治療，腫瘤為0或1+的患者受惠於該治療之可能性低。腫瘤為2+之患者，為了更為正確地決定腫瘤是否為HER2陽性，常會接受稱為螢光原位雜交(FISH法)之追加檢査。FISH法為測定基因之副本數的方法，含有多副本之HER2基因的腫瘤藉由FISH法會決定為HER2陽性。
    本發明之由包含核苷酸、載體或細胞構成的試藥，可用於檢測含有該核苷酸之核苷酸、載體、細胞等。
    本發明之試藥也可為組成物。
    包含該試藥之套組也包含在本發明之試藥。
    又，本發明之胜肽、胜肽衍生物、提示此等的細胞等，可當作識別標的分子等物質之元件而利用於針對該物質之生物感測件。 10.判定方法
    本發明也提供判定待驗物質是否結合於標的分子之方法。
    本發明之判定方法，可使用與本發明之鑑定方法包含之步驟為相同或經適當改變之步驟。惟，供該判定方法之待驗物質也可不包含在庫等集合。例如供判定方法之待驗胜肽或待驗胜肽衍生物，不限於胜肽庫包含之胜肽或胜肽衍生物，也可為從其他胜肽分離之單一胜肽或胜肽衍生物、包含此等之混合物等。亦即，本發明之鑑定方法，主要適於當作從待驗物質之物理性集合挑選具有理想的性質者的方法，相對於此本發明之判定方法，適於當作用於檢查特定之待驗物質是否具有理想的性質的檢定方法。
    本發明之判定方法中，例如決定待驗物質是否結合於標的分子之步驟中，可將是否滿足關於解離常數等親和性之指標的條件當作判定基準。又，與本發明之鑑定方法同樣在挑選步驟中，若能回收待驗物質當作結合於標的分子之物質時，則可判定該待驗物質為陽性。 [實施例]
    以下更具體說明本發明，但本發明不限於該等。 [實施例1]隨機變異TACI_d2噬菌體庫之製作 1)隨機變異TACI_d2寡核苷酸之合成
    合成下述寡核苷酸(183bp)。
    5’-G CTG CAC ACT GTA GGA GAA GAC TGG GCC CAG CCG GCC AGC CTG AGT TGC CGT AAA GAA CAG GGC AAG NNN TAT NNN NNN NNN NNN NNN GAC TGC NNN AGC TGC GCG AGC NNN TGT GGA NNN CAT CCT NNN NNN TGC GCG TAT TTT TGC GAA AAC GCG GCC GCG AGT CCA CGT TCC ATC GGT CA-3’(序列表之序列編號17：該鹼基序列中之「N」表示從ATGC選擇之任意之鹼基。)
    上述序列係從5‘末端起依序排列5’末端引子結合區、限制酶SfiI識別序列(SfiI部位)、加有隨機變異之TACI-d2之編碼序列、NotI部位、3‘末端引子結合區。又，NNN在編碼為除了Cys、Pro以外的18種之胺基酸(Ala、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Trp、Arg、Lys、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Ser、Met、Gly、Thr)之密碼子以大致等機率(各3.0%~8.2%)包含。藉此隨機變異TACI_d2於計算上之多樣性成為6.4×1013。 2)具有隨機變異TACI_d2噬粒載體之大腸桿菌TG-1株之製作
    以前述1)合成之寡核苷酸(共計2μg)當作模板，使用以下二種引子(Sigma genosys公司合成)進行PCR。
    朝前引子(Primer forward)1：GCTGCACACTGTAGGAGAAGACTGG(序列表之序列編號18)
    往後引子(Primer reverse)1：TGACCGATGGAACGTGGACTC(序列表之序列編號19)
    DNA聚合酶使用KOD-plus-ver.2(東洋紡績股份有限公司製)，黏合溫度64℃、伸長溫度68℃、循環數10，依說明書進行反應。將PCR產物以限制酶NotI-HF(NEB公司製)及SfiI(NEB公司製)消化，並將其當作插入物使用在後述接合。
    將噬粒載體pCANTAB 5E vector(舊稱Pharmacia公司-現GE Healthcare公司製)以限制酶NotI-HF(NEB公司製)及SfiI(NEB公司製)消化。然後，使用大腸桿菌來源的鹼性磷解酶(Alkaline Phosphatase)(Takarabio股份有限公司製)對於經限制酶消化之載體片段進行脫磷酸化處理，將其當作載體使用於後述接合。
    將上述插入物及載體使用T4 DNA Ligase(NEB公司製)接合(載體與插入物之莫耳比為1：3)。使用該接合產物，以電穿孔法將大腸桿菌TG-1株進行轉形(transformation)(使用BTX公司製BTX Electro Cell Manipulator 600，電壓1.98kV、電阻186歐姆)，接種於含有100μg/mL安比西林(安比西林)、1%葡萄糖之LB培養基(以下稱為LB/Amp/1%Glu)之平板，於30℃培養12小時以上，藉此獲得3.5×1010個大腸桿菌菌落。 3)隨機變異TACI_d2噬菌體之大量製備
    從2)之大腸桿菌菌落群使用含100μg/mL安比西林、1%葡萄糖的2×YT培養基(以下稱為2×YT/Amp/1%Glu)製備OD600nm=0.3之大腸桿菌懸浮液。於37℃進行振盪培養，使增殖至達OD600nm=0.5，添加足量的HYPERPHAGE M13K07△pIII(Progen公司製)，於37℃使感染30分鐘。其次，於該大腸桿菌添加100μg/mL安比西林、100μg/mL卡那黴素(Kanamycin)、0.25mM IPTG(以下稱為「2×YT/Amp/Kan/0.25mM IPTG」)，於22℃振盪培養一晚。於回收的培養上清中添加1/4量之20%聚乙二醇6000、2.5M NaCl溶液(以下稱為「20%PEG/2.5M NaCl溶液」)，使噬菌體沉澱。將沉澱的噬菌體以磷酸鹽緩衝鹽液(Phosphate Buffered saline)(以下稱為「PBS」)懸浮，當作隨機變異TACI提示噬菌體庫使用在以下的實驗。
    使該噬菌體溶液感染大腸桿菌TG-1株，接種於LB/Amp/1%Glu平板，並測定形成之菌落數。該噬菌體庫之力價(titer)為1.2×1013phage/mL。 [實施例2]結合於標的分子之TACI_d2變異體之選別 1)液相淘選法
    使用EZ-Link NHS-Chromogenic Biotin Reagent(Thermo SCIENTIFIC公司製)，依照說明書將標的蛋白質(標的分子)進行生物素化。對於該標的分子添加TACI_d2變異體提示噬菌體，使反應一晚或2小時。就TACI_d2變異體提示噬菌體而言，於液相淘選之第1回合使用隨機變異TACI_d2提示噬菌體庫，於第2回合以後使用從前回合獲得之大腸桿菌菌落群製備的噬菌體(隨機變異TACI_d2提示噬菌體庫)。於該混合溶液添加Dynabeads M-280鏈黴親合素(Streptavidin)(Invitrogen公司製：以下稱為「Dynabeads」)，使Dynabeads與生物素化標的分子結合。以含0.05%Tween-20之PBS(以下稱為「PBST」)將Dynabeads清洗既定次數後，使結合於Dynabeads表面之生物素化標的分子的TACI_d2變異體提示噬菌體以0.1M Glycine-HCl/500mM NaCl(pH2.2)溶出。將溶出之噬菌體立即以1M Tris-HCl(pH8.0)中和，並使感染大腸桿菌TG-1株，接種於LB/Amp/1%Glu平板，於30℃培養12小時。 2)固相淘選法
    於Nunc Maxisorp平底96井盤(Nunc)(以下稱為Maxisorp平盤)添加標的蛋白質(標的分子)，於4℃進行固相化一晚。於該Maxisorp平盤添加TACI_d2變異體提示噬菌體，使反應2小時。就TACI_d2變異體提示噬菌體而言，於固相淘選之第1回合使用隨機變異TACI_d2變異體提示噬菌體，第2回合以後使用從前回合獲得之大腸桿菌菌落群製備之噬菌體(隨機變異TACI_d2提示噬菌體庫)。以PBST將Maxisorp平盤清洗既定次數後，使與固相化於Maxisorp plate之標的分子結合之TACI變異體提示噬菌體以0.1MGlycine-HCl/500mM NaCl(pH2.2)溶出。將溶出之噬菌體立即以1M Tris-HCl(pH8.0)中和，使感染大腸桿菌TG-1株，接種於LB/Amp/1%Glu平板，於30℃培養12小時。 3)於次回合使用之噬菌體之製備
    從由次回合之淘選所獲得之大腸桿菌菌落群使用2×YT/Amp/1%Glu製備OD600nm=0.3之大腸桿菌懸浮液。於37℃進行振盪培養，使增殖至OD600nm=0.5，添加足量的助感染噬菌體M13K07，於37℃使感染30分鐘。於已感染助感染噬菌體之大腸桿菌添加2×YT/Amp/Kan/0.25mM IPTG，於22℃進行一晚振盪培養。於回收之培養上清中添加20%PEG/2.5M NaCl溶液，使噬菌體沉澱。將沉澱之噬菌體以PBS懸浮，使用在次回合之淘選。 4)結合於標的分子之TACI_d2變異體之選別
    以不含IgG、不含Protease之牛血清白蛋白(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.公司製：以下稱為「BSA」)、重組人類EphA2，CF(R&D systems公司製：以下稱為「hEphA2」)、重組人類EGF R/Fc Chimera，CF(R&D systems公司製：以下稱為「hEGFR/Fc」)、重組人類ErbB2/Fc Chimera，CF(R&D systems公司製：以下稱為「hErbB2/Fc」)、重組人類VEGF165(Peprotech公司製：以下稱為「hVEGF」)、重組人類TNF-α(Peprotech公司製：以下稱為「hTNF-α」)之6種重組蛋白質中任一者當作標的分子，進行3或4回合的液相或固相淘選。 [實施例3]由淘選所獲得之TACI_d2變異體(群)對於標的分子之結合活性評價 1)於phage ELISA中使用之噬菌體之製備①
    從由最終回合之淘選所獲得之大腸桿菌菌落群全體，使用2×YT/Amp/1%Glu製備OD600nm=0.3之大腸桿菌懸浮液。於37℃進行振盪培養，增殖至OD600nm=0.5，添加足量的助感染噬菌體M13K07，於37℃使感染30分鐘。於已感染助感染噬菌體之大腸桿菌添加2×YT/Amp/Kan/0.25mM IPTG，於22℃進行一晚振盪培養。於回收之培養上清中添加20%PEG/2.5M NaCl溶液，使噬菌體沉澱，將其以PBS懸浮。將該噬菌體之原液及以PBS重複進行2倍稀釋數次者使用在phage ELISA。 2)於phage ELISA中使用之噬菌體之製備②
    從最終回合之淘選所獲得之大腸桿菌菌落群選出單一菌落，接種於2×YT/Amp/1%Glu。於37℃進行振盪培養，使增殖至OD600nm=0.5，添加足量的助感染噬菌體M13K07，於37℃感染30分鐘。於已感染助感染噬菌體之大腸桿菌添加2×YT/Amp/Kan/0.25mM IPTG，於22℃進行一晚振盪培養。於回收之培養上清中添加20%PEG/2.5M NaCl溶液使噬菌體沉澱，使沉澱之噬菌體以PBS懸浮。將該噬菌體之原液及以PBS重複進行2倍稀釋數次者使用在phage ELISA。 3)phage ELISA
    於Maxisorp平盤添加標的分子或負對照蛋白質(以BSA當作標的分子時為hEphA2，以其他蛋白質當作標的分子時為BSA)，於4℃進行一晚固相化。於已固相化有標的蛋白質或負對照用蛋白質之Maxisorp平盤，添加實施例2之1)與2)製備之TACI變異體提示噬菌體，使反應2小時。以含0.05%Tween-20之Tris緩衝鹽液(以下稱為TBST)清洗Maxisorp平盤後，添加稀釋為5000倍之HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(GE Healthcare公司製)(以下稱為「抗M13抗體」)。再度以TBST清洗後，利用ELISA POD Substrate A.B.T.S.Kit(Nacalai Tesque公司製)(以下稱為「ELISA POD」)，檢測於波長405nm之吸光度當作結合於標的分子之噬菌體量。
    如第1圖(A)、(B)及(C)所示，利用淘選操作從TACI_d2隨機變異庫挑選或濃縮各結合於標的分子之TACI變異體(群)。 實施例4]野生型TACI_d2與hEphA2結合性TACI_d2變異體之專一性之比較 1)於phage ELISA中使用之噬菌體之製備
    針對從以hEphA2當作標的分子進行最終回合淘選後之大腸桿菌菌落群所選出的3個選殖體(各對應於α-EphA2 #1至#3：序列表之序列編號2至4、第4圖之2至4)，使用2×YT/Amp/1%Glu製備OD600nm=0.3之大腸桿菌懸浮液。將該等大腸桿菌各於37℃進行振盪培養，使增殖至達OD600nm=0.5，添加足量之助感染噬菌體M13K07，於37℃使感染30分鐘。於已感染助感染噬菌體之大腸桿菌添加2×YT/Amp/Kan/0.25mM IPTG，於22℃進行一晚振盪培養。於回收之培養上清中添加20%PEG/2.5M NaCl溶液，使噬菌體沉澱，使沉澱之噬菌體以PBS懸浮。將該噬菌體之原液及以PBS重複進行2倍稀釋數次者使用在phage ELISA。針對具有含野生型TACI_d2基因之pCANTAB5E載體的大腸桿菌TG-1株，也以同樣操作製備噬菌體。 2)phage ELISA
    於Maxisorp平盤，分別添加在由hEphA2、BSA、Recombinant Human BAFF/BLyS/TNFSF13B(R&D systems：人類BAFF((UniProtKB/Swiss-Prot Accession # Q9Y275)之134位之Ala至285位之Leu的胺基酸所構成的多胜肽之N末端連結有組胺酸．標籤等者：以下稱為「hBAFF」)、在由Recombinant Mouse EphA2/Fc Chimera，CF(R&D systems：小鼠EphA2(NCBI Accession No.#AAA82113)之22位之Ala至535位之Ala之胺基酸所構成的多胜肽之C末端連結有人類免疫球蛋白G1(以下稱為「hIgG1」)之Fc區(100位之Pr至330位之Lys)者：以下稱為「mEphA2/Fc」)，於4℃進行一晚固相化。在該等Maxisorp平盤添加TACI_d2變異體提示噬菌體，使反應2小時。將Maxisorp平盤以TBST清洗後，添加稀釋為5000倍之抗M13抗體。再度以TBST清洗Maxisorp平盤後，利用ELISA POD檢測波長405nm之吸光度當作與固相化於平板之蛋白質結合之噬菌體量。
    結果如第2圖(A)及(B)。取得結合於hEphA2之TACI_d2之變異體、α-EphA2#1至#3。該等之中，α-EphA2 #1至#3均喪失對於為野生型TACI_d2之內因性配體hBAFF的結合能力。又，對於mEphA2之交又反應性雖然α-EphA2 #2及#3與野生型TACI_d2為同程度，但是α-EphA2 #1比起此等為較強。 [實施例5]hEphA2結合性TACI_d2變異體對於人類EphA2表現細胞之結合之確認 1)細胞培養及培養基
    將人類胎兒腎臓細胞(HEK293T細胞)使用含10%胎牛血清(FBS)之Dulbecco修飾Eagle培養基(以下稱為「DMEM」：GIBCO公司製)(以下將該培養基稱為「DMEM-10%FBS」)於37℃於5%CO2存在下培養。使用於轉染或流式細胞計數法時，係使用0.05%胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)從培養用平板剝離後，將細胞懸浮物離心分離並回收細胞，再度懸浮於DMEM-10%FBS後使用。 2)轉染
    使用Lipofectamin2000(Invitrogen公司製)依照說明書，將人類EphA2基因或當作負對照之插入有人類ErbB2基因之pcDNA-DEST40 Gateway載體(Invitrogen公司製)對於HEK293T細胞轉染。 3)細胞之製備
    回收經轉染之細胞，將細胞懸浮於FACS緩衝液(含5%FBS之PBS)，通過尼龍網。以5×105個細胞/井分注於有蓋圓底之96井細胞培養簇集(Coster公司製)，離心去除上清。對於該細胞，逐一添加實施例4之1製備之噬菌體之原液50μL，於4℃靜置30分鐘。添加150μL/井之FACS緩衝液，以離心去除上清，再度添加200μL/井之FACS緩衝液，以離心去除上清(以下的細胞清洗亦同樣進行)。對所獲得之細胞以50μL/井添加當作一次抗體之稀釋為100倍之抗M13抗體，於4℃靜置30分鐘後清洗細胞。然後，添加當作二次抗體之稀釋為1000倍之FLUORESCEIN-CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG(CAPPEL公司製)，於4℃靜置30分鐘後清洗細胞。將所獲得之細胞以250μL的FACS緩衝液懸浮，供Cytomics FC 500 Flow Cytometry System(BECKMAN COULTER公司製)之用，檢測經螢光染色之細胞。
    結果如第3圖(A)及(B)。α-EphA2 #1及#2不只是對hEphA2/Fc，對於在細胞表面上表現之人類EphA2也有結合。 [實施例6]各種結合於標的分子之TACI_d2變異體之序列解析
    與實施例3之2)、3)同樣進行，針對已確認對於各種標的分子有結合之TACI_d2變異體胜肽，單離表現該胜肽之大腸桿菌，並以2xYT培養基於37℃培養一晚。使用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN公司製)，從回收之大腸桿菌製備插入有編碼為該胜肽之基因的pCANTAB 5E載體。針對該載體，使用pCANTAB-S1引子(5’-CAACGTAAAAAATTATTATTCGC-3’：序列表之序列編號20)，決定鹼基序列。
    內在性之TACI結合分子使用前述hBAFF。
    (1)上皮成長因子受體(epidermal growth factor receptor：EGFR)
    挑選結合於人類EGFR之細胞外分域之TACI_d2變異體，並進行獲得之胜肽之胺基酸序列解析。
    就人類EGFR而言，使用EGFR之細胞外分域(UniProtKB/Swiss-Prot Accession # P00533之25位之Leu至645位之Ser)與hIgG1之Fc區(100位之Pro至330位之Lys)的融合蛋白質(前述hEGFR/Fc)。
    獲得之胜肽3種之胺基酸序列，為序列表之序列編號5號至7號(第4圖之5至7)。
    (2)血管內皮成長因子(VEGF)
    VEGF使用人類同型異構物(isoform)VEGF165(CAS登錄檔案之登錄號碼1217406-67-1：前述hVEGF)。
    挑選結合於人類VEGF之TACI_d2變異體，進行獲得之6種胜肽之胺基酸序列之解析。其結果，如序列表之序列編號8號至13號(第4圖之8至13)所示。
    (3)腫瘤壞死因子α(TNF-α)
    TNF-α使用人類TNF(CAS登錄檔案之登錄號碼1228062-30-3：前述hTNF-α)。
    挑選結合於人類TNFα之TACI_d2變異體，解析獲得之3種胜肽之胺基酸序列。其結果如序列表之序列編號14號至16號(第4圖之14至16)所示。
    (4)上述(1)至(3)中，獲得之結合於標的分子任一者的TACI_d2變異體中均為，TACI_d2構造內部的78位、亦即序列表之序列編號1之11位之Phe取代成為其他之胺基酸。 [實施例7]VEGF結合性TACI_d2變異體對於VEGF之解離常數之測定
    將實施例2中所獲得之hVEGF結合性TACI_d2變異體(第4圖之9號：序列表之序列編號9號)之基因以PCR法放大，插入於大腸桿菌表現用載體pET-32a(Novagen公司)。使用該載體，將大腸桿菌OrigamiTMB株(MERCK公司)轉形，於37℃振盪培養至成為OD600nm=0.7。添加IPTG使終濃度成為1mM，誘導該變異體表現後，於16℃進行12小時以上振盪培養。將培養的大腸桿菌進行超音波破碎，離心並將所獲得之上清施用HisTALONTM管柱(clontech公司)精製。於表現的該變異體已加成有Thioredoxin-標籤及His-標籤，但將此等使用Thrombin cleavage capture kit切斷，再度施用於HisTALONTM管柱以除去。將經精製之該變異體施用於尺寸排除層析(Superdex75 HR 10/30管柱，GE Healthcare公司)，回收相當於該變異體(單元體)之分子量的峰部，供親和性解析。該變異體之親和性使用利用cBiacore 3000(GE Healthcare)之表面電漿子共振法決定。對於固定於感應晶片上的hVEGF流過各種濃度的該變異體，並且從獲得之感應圖，決定該變異體對於hVEGF之解離常數。其結果，該變異體對於hVEGF之解離常數為14μM。 [產業上之可利用性]
    本發明之胜肽庫對於挑選結合於標的分子之胜肽係有用。 [無序列表之文字]
    序列編號2-人類EphA2結合性胜肽α-EphA2 #1之胺基酸序列
    序列編號3-人類EphA2結合性胜肽α-EphA2 #2之胺基酸序列
    序列編號4-人類EphA2結合性胜肽α-EphA2 #3之胺基酸序列
    序列編號5-人類EGFR結合性胜肽(1)之胺基酸序列
    序列編號6-人類EGFR結合性胜肽(2)之胺基酸序列
    序列編號7-人類EGFR結合性胜肽(3)之胺基酸序列
    序列編號8-人類VEGF結合性胜肽(1)之胺基酸序列
    序列編號9-人類VEGF結合性胜肽(2)之胺基酸序列
    序列編號10-人類VEGF結合性胜肽(3)之胺基酸序列
    序列編號11-人類VEGF結合性胜肽(4)之胺基酸序列
    序列編號12-人類VEGF結合性胜肽(5)之胺基酸序列
    序列編號13-人類VEGF結合性胜肽(6)之胺基酸序列
    序列編號14-人類TNFα結合性胜肽(1)之胺基酸序列
    序列編號15-人類TNFα結合性胜肽(2)之胺基酸序列
    序列編號16-人類TNFα結合性胜肽(3)之胺基酸序列
    序列編號17-隨機變異TACI_d2寡核苷酸之鹼基序列
    序列編號18-PCR引子Primer Forward 1之鹼基序列
    序列編號19-PCR引子Primer Reverse 1之鹼基序列
    序列編號20-鹼基序列決定用引子pCANTAB-S1 primer之鹼基序列
    第1圖(A)、(B)及(C)顯示對於為標的分子之各蛋白質進行淘選而獲得之TACI_d2變異體結合於各蛋白質之圖。
    淘選使用之標的分子，在第1圖(A)之(1)及(2)各為BSA及hEphA2、第1圖(B)之(3)及(4)各為hEGFR/Fc及hErbB2/Fc、第1圖(C)之(5)及(6)各為hVEGF、及(6)hTNF-α。
    第1圖(A)之(1)及(2)及第1圖(B)之(3)及(4)為聚選殖體(polyclone)、第1圖(C)之(5)及(6)為單一選殖體(monoclone)之例。
    第2圖(A)及(B)係比較結合於重組人類EphA2之TACI_d2變異體#1至#3(以下稱為α-EphA2 TACI_d2 #1至#3)與野生型TACI_d2之專一性之圖。
    固相化蛋白質於第2圖(A)之(1)及(2)各使用hEphA2及BSA，第2圖(B)之(3)及(4)各使用hBAFF及mEphA2/Fc。
    第3圖(A)及(B)係比較α-EphA2 TACI_d2 #1至#3及野生型TACI_d2對於人類EhpA2表現細胞之結合性之圖。
    第3圖(A)之(1)及(2)各代表針對α-EphA2 TACI_d2 #1(α-EphA2 #1)及α-EphA2 TACI_d2 #2(α-EphA2 #2之分析結果。
    第3圖(B)之(3)及(4)各代表針對α-EphA2 TACI_d2 #3(α-EphA2 #3)及野生型TACI_d2(WT)之分析結果。
    比較對象之細胞各使用人類EphA2表現細胞(a)及人類ErbB2表現細胞(b)。
    α-EphA2 TACI_d2 #1及#2(α-EphA2 #1、及α-EphA2 #2)對於人類EphA2表現細胞有專一性結合。
    第4圖顯示對於標的分子為專一性結合之TACI_d2變異體具有之胺基酸序列之一覧。打上＊號之處代表不存在該胺基酸Ser(缺失)。WT表示野生型之胺基酸序列。X(打上X之處)相當於序列編號1表示之胺基酸序列中的Xaa(的位置)。
    <110> 第一三共股份有限公司
    <120> 胜肽庫
    <130> W2-JP-Appl-2011-01
    <150> JP2011-020559
    <151> 2011-02-02
    <160> 21
    <170> PatentIn version 3.5
    <210> 1
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 人造序列之敘述
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (11)..(11)
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (13)..(17)
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (20)..(20)
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (25)..(25)
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (28)..(28)
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> MISC_FEATURE
    <222> (31)..(32)
    <223> 任意胺基酸
    <400> 1
    <210> 2
    <211> 38
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 2
    <210> 3
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 3
    <210> 4
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 4
    <210> 5
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 5
    <210> 6
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 6
    <210> 7
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 7
    <210> 8
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 8
    <210> 9
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 9
    <210> 10
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 10
    <210> 11
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 11
    <210> 12
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 12
    <210> 13
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 13
    <210> 14
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 14
    <210> 15
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 15
    <210> 16
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 16
    <210> 17
    <211> 39
    <212> PRT
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 17
    <210> 18
    <211> 183
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (68)..(70)
    <223> n為a、c、g、或t
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (74)..(88)
    <223> n為a、c、g、或t
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (95)..(97)
    <223> n為a、c、g、或t
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (110)..(112)
    <223> n為a、c、g、或t
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (119)..(121)
    <223> n為a、c、g、或t
    <220>
    <221> misc_feature
    <222> (128)..(133)
    <223> n為a、c、g、或t
    <400> 18
    <210> 19
    <211> 25
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 19
    <210> 20
    <211> 21
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 20
    <210> 21
    <211> 23
    <212> DNA
    <213> 人造序列
    <220>
    <223> 任意胺基酸
    <400> 21
    权利要求:
    Claims (35)
    [1] 一種胜肽，其係選自於下述(i)或(ii)：(i)一胜肽，具有序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列；及(ii)一胜肽，具有於序列表之序列編號1所表示之胺基酸序列中，自胺基末端數起1位至11位之Xaa以外之1個以上28個以下之胺基酸進行保守性胺基酸取代、缺失、加成或插入而成的胺基酸序列。
    [2] 如申請專利範圍第1項之胜肽，其中自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為排除半胱胺酸之任意之胺基酸。
    [3] 如申請專利範圍第1或2項之胜肽，其中自胺基末端數起1位至11位之Xaa各為排除脯胺酸之任意之胺基酸。
    [4] 如申請專利範圍第1至3項中任一項之胜肽，其中保守性胺基酸取代係於選自於疏水性胺基酸群組、中性親水性胺基酸群組、酸性胺基酸群組、鹼性胺基酸群組、會影響主鏈方位的胺基酸之群組、及芳香族胺基酸群組中任一群組內進行。
    [5] 如申請專利範圍第1至4項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起1位之Xaa係選自於由麩醯胺酸、甲硫胺酸、組胺酸、絲胺酸、麩胺酸、天冬醯胺酸、色胺酸、異白胺酸、天冬胺酸及蘇胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [6] 如申請專利範圍第1至5項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起2位之Xaa係選自於由色胺酸、白胺酸、甘胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸及蘇胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [7] 如申請專利範圍第1至6項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起3位之Xaa係選自於由精胺酸、白胺酸、丙胺酸、組胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸及絲胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [8] 如申請專利範圍第1至7項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起4位之Xaa係選自於由麩胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、酪胺酸、甘胺酸及苯丙胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [9] 如申請專利範圍第1至8項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起5位之Xaa係選自於由離胺酸、麩胺酸、甲硫胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、組胺酸及色胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [10] 如申請專利範圍第1至9項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起6位之Xaa係選自於由甲硫胺酸、色胺酸、酪胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸及天冬胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [11] 如申請專利範圍第1至10項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起7位之Xaa係選自於由麩胺酸、天冬胺酸、丙胺酸、絲胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸及天冬醯胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [12] 如申請專利範圍第1至11項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起8位之Xaa係選自於由離胺酸、麩胺酸、丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、精胺酸及甘胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [13] 如申請專利範圍第1至12項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起9位之Xaa係選自於由天冬醯胺酸、絲胺酸、酪胺酸、麩胺酸、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸及組胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [14] 如申請專利範圍第1至13項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起10位之Xaa係選自於由天冬胺酸、組胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、天冬醯胺酸、纈胺酸及白胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [15] 如申請專利範圍第1至14項中任一項之胜肽，其中自胺基末端數起11位之Xaa係選自於由異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸及纈胺酸所構成之群組中的胺基酸。
    [16] 如申請專利範圍第1至15項中任一項之胜肽，其具有序列表之序列編號1至16中任一者表示之胺基酸序列。
    [17] 一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽之衍生物，係對於該胜肽實施化學性修飾或生物學性修飾而成。
    [18] 一種核苷酸，其係下述(i)至(iii)中任一者：(i)一核苷酸，係包含由編碼為如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成之核苷酸而成；(ii)一核苷酸，係包含編碼為如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列而成；及(iii)一核苷酸，係由編碼為如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽具有之胺基酸序列的鹼基序列構成。
    [19] 一種載體，其係包含如申請專利範圍第18項之核苷酸而成。
    [20] 一種細胞，其係導入有如申請專利範圍第18項之核苷酸或如申請專利範圍第19項之載體。
    [21] 一種如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽之製造方法，其係包含下述步驟(i)及(ii)而成：(i)培養如申請專利範圍第20項之細胞；及(ii)從步驟(i)所獲得之培養物回收該胜肽。
    [22] 一種胜肽庫，其係包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽及/或如申請專利範圍第17項之胜肽之衍生物而成。
    [23] 如申請專利範圍第22項之胜肽庫，其中胜肽及/或胜肽之衍生物係利用包含如申請專利範圍第21項之步驟(i)及(ii)而成的方法製備者。
    [24] 如申請專利範圍第22或23項之胜肽庫，其中在該胜肽庫中，為表現型(phenotype)的該胜肽或胜肽衍生物及該表現型所對應之基因型(genotype)核苷酸係直接的或間接的連結。
    [25] 如申請專利範圍第22至24項中任一項之胜肽庫，其中該核苷酸為如申請專利範圍第18項之核苷酸。
    [26] 如申請專利範圍第22至25項中任一項之胜肽庫，其係噬菌體呈現庫、核糖體呈現庫或核酸呈現庫。
    [27] 一種結合於標的分子之如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽或如申請專利範圍第17項之胜肽衍生物之鑑定方法，其係包含下述(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如申請專利範圍第22至26項中任一項之胜肽庫包含之胜肽或胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收該結合於標的分子之胜肽或胜肽衍生物。
    [28] 一種結合於標的分子之如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽或如申請專利範圍第17項之胜肽衍生物之製造方法，其係包含下述(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如申請專利範圍第22至26項中任一項之胜肽庫包含之胜肽或胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)回收該結合於標的分子之胜肽或胜肽衍生物；及(iii)將於前述(ii)回收之該胜肽或胜肽衍生物包含之胜肽利用化學合成、基因重組或體外轉譯製備。
    [29] 一種判定如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽或如申請專利範圍第17項之胜肽之衍生物是否結合於標的分子之方法，其係包含下述(i)及(ii)之步驟而成：(i)使如申請專利範圍第1至16項中任一項之待驗胜肽或如申請專利範圍第17項之待驗胜肽衍生物與該標的分子接觸；及(ii)當待驗胜肽或待驗胜肽衍生物結合於該標的分子時，決定該胜肽或待驗胜肽衍生物為陽性。
    [30] 一種結合於標的分子之如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽或如申請專利範圍第17項之胜肽之衍生物之製造方法，其係包含下述(i)至(iii)之步驟而成：(i)使如申請專利範圍第1至16項中任一項之待驗胜肽或如申請專利範圍第17項之待驗胜肽衍生物與該標的分子接觸；(ii)當待驗胜肽或待驗胜肽衍生物結合於該標的分子時，決定該胜肽或待驗胜肽衍生物為陽性；及(iii)當於前述(ii)判定待驗胜肽或胜肽衍生物為陽性時，將該胜肽或胜肽衍生物包含之胜肽利用基因重組或體外轉譯進行製備。
    [31] 一種核苷酸庫，其係包含如申請專利範圍第18項之核苷酸而成。
    [32] 如申請專利範圍第31項之核苷酸庫，其中核苷酸為噬粒、黏質體(cosmid)或質體或其片段。
    [33] 如申請專利範圍第31或32項之核苷酸庫，其中核苷酸存在於原核或真核細胞內、或病毒DNA或RNA上或病毒粒子中。
    [34] 一種組成物，其係包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽、如申請專利範圍第17項之胜肽之衍生物、如申請專利範圍第18項之核苷酸、如申請專利範圍第19項之載體或如申請專利範圍第20項之細胞而構成。
    [35] 一種試藥，其係包含如申請專利範圍第1至16項中任一項之胜肽、如申請專利範圍第17項之胜肽之衍生物、如申請專利範圍第18項之核苷酸、如申請專利範圍第19項之載體或如申請專利範圍第20項之細胞而構成。
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